使用salmon计算RNA-seq表达量矩阵

传统的RNA-seq分析方法需要将reads比对到基因组上，然后再统计每个基因的counts，进而计算TPM/FPKM。现在，发展出了许多alignment-free的方法，不需要进行比对，直接统计出count矩阵。

安装

salmon直接提供了linux的预编译版本，解压后可直接使用。

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wget https://github.com/COMBINE-lab/salmon/releases/download/v0.12.0/salmon-0.12.0_linux_x86_64.tar.gz

准备输入数据

参考转录组，即目标物种的cdna序列
比对文件(alignment-based mode)或测序文件(quasi-mapping-based mode)

是的，salmon可以不经过比对，直接以测序数据作为输入

建立索引

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salmon index -t transcripts.fasta -i transcripts_index --type quasi -k 31

# -t： 参考转录组路径，支持压缩文件
# -i： 设定index名称
# -type： 索引类型，分为fmd, quasi, 建议quasi
# -k: k-mers的长度。说明文档中，若reads长度大于75 bp，取值31可获得较好的效果

salmon index -t transcripts.fasta -i transcripts_index
# 全部使用默认参数也可创建索引

20190622 更新

在0.14.0 新版本中，salmon引入了新的索引方式，且旧版本产生的索引不能在0.14.0版本后通用

新的方式依赖于SalmonTools中提供的脚本，提供基因组，gtf注释与cds序列，生成decoys.txt与gentrome.fa
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bash /path/to/scripts/generateDecoyTranscriptome.sh -a ~/reference/annotation/mm/mm.gtf -g ~/reference/genome/mm/mm.fasta -t ~/reference/collection/mm/mm.cds.fa -o mm
cd mm
salmon index -t gentrome.fa -d decoys.txt -i ./

定量计算

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salmon quant -i transcripts_index  -l A -1 reads_1.fastq -2 reads_2.fastq -o transcripts_quant

# -i： 上一步建立好的index路径
# -l/--libType: 文库类型，详细参见文档，可设置为A，使用软件自动适配
# -1： read1，支持压缩文件
# -2： read2，支持压缩文件
# -o： 输出目录

导出表达量矩阵

使用tximport导入或导出上游软件计算的表达量矩阵

count矩阵

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files <- file.path(dir, "salmon", samples$run, "quant.sf.gz")
names(files) <- paste0("sample", 1:6)
txi.salmon <- tximport(files, type = "salmon", tx2gene = tx2gene)
head(txi.salmon$counts)

DEGList(txi.salmon)